东南大学司伟博士: 纳米孔单分子测序为最具潜力DNA测序技术
更新时间:2021-06-08 02:06 发布者:

1996年,Kasianowicz等人初次发现单链DNA和RNA电泳穿过α溶血素纳米孔的时分会发生对应的堵塞电流信号。尔后,许多科研学者在这一研讨根底上开端了更为广泛的研讨。经过二十余年开展,生物纳米孔技能现已开端商业化,且市道已有成型的根据生物纳米孔单分子尊龙d88娱乐测序技能的基因测序仪产品。

纳米孔最具远景的使用之一是其能够用于第三代DNA测序技能,因其不需求杂乱的酶扩增以及荧光符号,且其具有低本钱高通量的特色而遭到广阔研讨者们的喜爱。


纳米孔是单分子测序仪最中心部件

图1 纳米孔DNA测序的根本原理图。根据纳米孔的DNA测序传感器建立示意图,图中显现一条单链DNA正在电泳穿过石墨烯纳米孔。单链DNA过孔时发生的堵塞离子电流信号细节示意图,每个碱基的体积及其与纳米孔之间的相互效果强度不同导致对应的堵塞电流幅值存在差异,然后能够用来区别不同的DNA碱基。

纳米孔单分子DNA测序传感器根据库特计数器原理,如图1所示在固态薄膜的顺式端和反式端都注满了离子溶液,两头的溶液仅经过纳米孔进行衔接,当带电的DNA分子被置入到液池的顺式端后,在纳米孔的两边施加电压,DNA分子会在电场力的效果下电泳穿过纳米孔,由于DNA碱基本身在孔内的物理占位以及其与纳米孔间较强的相互效果使得经过纳米孔的电流会被堵塞。一条单链DNA由腺嘌呤,鸟嘌呤,胸腺嘧啶和胞嘧啶组成。由于四种碱基的尺度及特征各异,当单链DNA穿过跟本身尺度适当的纳米孔时,不同的碱基会发生对应幅值的堵塞电流,经过研讨这些电流之间的差异就能够完结对DNA四种碱基的辨识,如图1所示。经过剖析这些堵塞电流信号,DNA链上所含的碱基很有或许被检测和区别开来。

纳米孔作为单分子测序仪器规划与制作的中心检测部件,因而怎么确保纳米孔单分子传感器的检测灵敏度、时刻空间分辨率、安稳性和寿数等是影响纳米孔单分子测序仪器工作效率和安稳性的要害技能问题。


三大技能打破成果了现在的纳米孔单分子测序仪

自1996年纳米孔被Kasianowicz等人发现以来,许多科学家投入许多精力深入研讨,在研讨过程中也遇到许多难题。

例如,尽管研讨者们都相继报导了纳米孔离子电流能够用于四种碱基的区别,可是他们得到的定论却截然不同,使得堵塞电流的幅值和相应碱基之间的对应联系至今仍然含糊不清。研讨者们对单链DNA均聚物在过孔时发生的堵塞电流幅值跟碱基体积巨细的相关性进行了研讨,组成DNA四种碱基的体积巨细次序为G>A>T>C,理论上DNA碱基的尺度对离子电流信号的影响较大,可是其与纳米孔的强相互效果在堵塞电流幅值检测方面也会起到主导效果,且在不同的纳米孔资料或许试验条件下取得的试验成果差异较大,这也约束了根据纳米孔DNA测序的开展。

阅历了20余年的开展,三大技能打破与改造也成果了如今的纳米孔单分子测序仪的研发。首先是纳米孔检测DNA或RNA全新技能方案的提出,其次是选用酶对DNA分子的剪切或仿制用于纳米单分子测序技能中,最终是单碱基信号的测序精度精准调控。之后数年的时刻,Oxford Nanopore 公司于2013年11月启动了MinION测序仪的前期试用方案,这时首款纳米孔单分子测序仪也正式开端步入人类的视界。


便携、低本钱和高通量  纳米孔单分子测序成为最具潜力的DNA测序技能

人类基因组方案人类基因组方案在2003 年完结人体全序列的基因测定,历时12 年,耗资数十亿美元,人类基因序列图已成为全人类一起的财富。可是,第一代的 Sanger测序办法也给基因组测序贴上了数亿美元的价格标签,让人望而生畏。近两年开展迅猛的第二代测序仪让人类基因组重测序的费用降低到10 万美元以下,测序时刻也缩短到6 个月。可是,这样的价格和时刻,相对于个人用户仍然太高,极大地约束了其临床使用和根底理论研讨。

与传统Sanger测序技能比较,纳米孔单分子测序技能的中心优势在于它的便携性、低本钱和高通量。

强壮的商场需求和探究生命科学未知领域的巴望,有力地推动着DNA 检测水平的进步。2004 年,美国国家人类基因组研讨所启动了“千元基因组测序研讨项目”, 意图是让人类基因组的测序费用降至1000 美元以下。根据纳米孔的单分子DNA 测序办法是第三代测序技能中本钱最低,最具有竞争力的技能。同年,美国国家卫生研讨院提出了“1000美元测序”的概念,而根据纳米孔的DNA测序技能是最有潜力完结这一方针的办法之一,许多试验研讨也进一步验证了纳米孔DNA测序技能的可行性。

该办法的优势在于它简化了对DNA 的化学修饰、扩增和外表吸附等工艺,具有结构简练、速度快、操作简洁等特色,一起省去了贵重的荧光试剂和CCD照相机的费用。最为重要的是它的效率高,单个核苷酸分子经过纳米孔的时刻仅在微秒级,假如考虑单个芯片上集成成百上千个纳米孔阵列,有望在24 小时内完结对个别的基因测序,而现在的二代基因测序仪则需求6 个月时刻。


商业化开展慢  进步纳米孔安稳性火烧眉毛

纳米孔单分子测序技能现有商场的典型产品是Oxford Nanopore Technologies公司的MinION纳米孔测序仪,它具有低本钱、高通量、读速快、读长长和高便携等特色,因而纳米孔单分子传感器现在已被广泛使用于物理学、生物学和化学等学科触及单分子使用的科学研讨,助力人类科技的开展,造福人类。

根据上述纳米孔单分子测序技能的特色,比较传统测序仪器而言,它的典型使用场景之一是极点环境中病毒或细菌的高精度检测。例如,在偏僻贫困地区,在疫情迸发或在没有满足的设备资源的情况下,便携的纳米孔单分子测序仪能够快速的帮忙病毒检测和疾病诊断。数年前西非迸发埃博拉病毒时,单分子测序仪便在病毒检测过程中起到的重要效果。再例如,存放在外太空空间站的土壤和水等是否现已呈现微生物仍然成谜,要将样品带至地球进行采样剖析方能揭晓,而简便的纳米孔单分子测序仪仅有u盘巨细,能够便利的携带至外太空,在其他辅佐条件下帮忙检测。

尽管根据纳米孔的单分子测序仪具有许多优势,并且现已进入商业化进程,可是它的商场占有率比较传统测序技能而言仍然偏低。其原因首要是现在商场已有的纳米孔测序仪选用的仍然是生物纳米孔和磷脂膜,这样的生物系统不可避免的面临着寿数短和安稳性不耐久的缺点。因而要推动纳米孔单分子测序技能的开展,这些问题有必要得到处理。而固体纳米孔现在的报导也能够辨识单碱基,因而固体纳米孔有望在未来替代生物纳米孔完结安稳、可重复使用的高精度DNA测序。可是固体纳米孔在信噪比方面不如生物纳米孔,并且DNA在相同条件下经过固体纳米孔的速度偏快,因而怎么进步固体纳米孔的信噪比和完结有用的DNA控速也是亟需处理的要害科学问题。


作者简介:

司伟,博士,东南大学硕导/讲师,2020年度东南大学“至善青年学者”,江苏省2019年度优异博士学位论文和东南大学2019年度优异博士学位论文取得者,当选2019年、2020年东南大学机械工程学院“优才培养方案”,担任《MaterialsInternational》期刊助理修改和《Bioengineering International》期刊编委,取得2019年Nanotechnology期刊出色审稿人奖。首要研讨方向:机械控制及机器人技能、工程流体动力学及传感器、结构工艺规划及加工制作、程序语言算法和三维建模与仿真。